质粒的提取和纯化实验

质粒的提取和纯化实验

1、该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净,获得一定得率的质粒DNA.去掉染色体DNA*为重要,也较困难,因为在全部提取过程中,只有一次机会去除染色体DNA,其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时,控制变性与复性操作时机,既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性,又要使染色体DNA不断裂解成小片段,从而能与质粒DNA相分离.这就要求试剂与溶菌液充分摇匀,摇动时用力适当,一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次,因为此时**还没有与碱和SDS作用,染色体DNA尚未释放,不必担心其分子断裂,加入SDS后,则要注意不能过分用力振荡,温和混匀,但又必须让它反应充分.加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理! 
    2、加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.
    3、加乙醇沉淀DNA时,要把离心管加盖倒翻摇动4～5次,注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后,才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA.
    4、乙醇沉淀DNA离心后,要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出).否则,用TE缓冲液溶解DNA时,既困难又不完全.
    5、为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带,加入1μl RNA酶,将管置50℃水浴箱内30min,消化RNA.
    6、抽提产物经电泳分离、EB染色后,在紫外线灯下可观察到三个条带,自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA.